Специфическая активность полипренольного препарата "Ропрен" при токсическом поражении печени в эксперименте.// "Клиническое питание". - 2007. - 3. - С. 28-32.

Е.Н. Лаптева, проф., д.м.н., В.И. Рощин, проф., д.х.н., В.С. Султанов, к.х.н.

 

Специфическая активность полипренольного препарата "Ропрен" (Bioeffective® R) при токсическом поражении печени в эксперименте

 

В экспериментальном исследовании изучена гепатопротекторная активность полипреноль­ного препарата «Ропрен» на модели токсического поражения печени, индуцированного дихло­рэтаном или ацетаминофеном у крыс. Препарат  «Ропрен» представляет собой концентрат полипренолов, выделенных из хвои сосны(Pinus silvestris) и ели (Picea abies). Препарат  «Ропрен» значи­тельно улучшает функциональное и морфологическое состояние печени у жи­вотных, подвергнутых воздействию гепатотоксических агентов. Действие препарата направлено на   стимуляцию репаративно-регенерационных процессов в печени, на повышение устойчивости органа за счет мембрано-стабилизирующего, антитоксического и антиоксидантного действия, на восстановление белоксинтезирующей функции гепатоцитов.

 

 

 

 Лечение и профилактика заболева­ний печени являются одной из актуаль­ных проблем современной медицины [4, 6, 7, 20, 21]. Этиологическую роль в развитии заболеваний печени могут играть разнообразные факторы, в том числе, вирусы, гормональные и метабо­лические нарушения, токсические пора­жения, вызванные самыми разнообраз­ными веществами (алкоголь, эфиры и эпоксидные соединения, ароматические амины, лекарственные противогрибко­вые и противотуберкулезные препараты, нестероидные противовоспалительные средства и др.).  В соответствии с современными принципами лечения заболеваний печени, программа комплексной терапии этой патологии включает два основных направления. Первое представляет этиотропную терапию, направленную на подавление патологического возбудителя, его элиминацию и санацию организма. В клинической практике этиотропную терапию применяют только при вирусных гепатитах с парентеральным механизмом заражения. Второе направление соответствует патогенетической терапии, имеющей целью адекватную фармакологическую коррекцию универсальных, мультифакторных звеньев патогенеза. В целом, ассортимент лекарственных средств, применяемых в комплексной терапии заболеваний печени и желчевыводящих путей, насчитывает более 1000 наименований. Однако среди такого многообразия препаратов выделяют сравнительно небольшую группу оказывающих избирательное действие на печень - гепатопротекторов. К сожалению, на сегодняшний день ни один из использующихся в медицинской практике гепатопротекторов не удовлетворяет в полной мере всем требованиям, хотя в последние годы арсенал современных гепатозащитных средств и расширился как за счет появления синтетических препаратов, так и новых природных средств. В целом, в настоящее время, преобладающее использование имеют средства растительного происхождения (до 54%), в то время как на фосфолипидные препараты приходится 16%, а на другие средства, в том числе синтетические - 30% от общего количества "истинных" гепатозащитных препаратов. В современной гепато­логии одно из ведущих мест занимают препараты, защищающие печень от по­вреждающего воздействия экзогенных или эндогенных факторов и усиливаю­щие ее нормальную регенерацию. Поиск новых препаратов растительного проис­хождения, обладающих гепатопротек­торными свойствами, является актуаль­ной проблемой [5, 8, 22].

       Новый растительный препарат «Ропрен» является  концентратом полипренолов, выделенных из хвои сосны(Pinus silvestris)  и ели(Picea abies) [2,3]. Пренолы являются растительным ана­логом эндогенного транспортного ли­пида – долихола, который обеспечива­ет реакции гликолизирования в доли­хилфосфатном цикле во время синтеза гликопротеидов [9–20].  Они представляют собой продукты изопреноидного пути, наряду с дигоксином (ингибитором мембранной Na-K АТФазы) и убихиноном (связывающим свободные радикалы). Долихолы  в организме участвуют в процессах фосфорилирования.  Считается, что именно фосфаты долихолов являются наиболее физиологически активными регуляторами и  мембрано-активными участниками транспорта гидрофильных частиц через мембрану. Долихолы располагаются внутри фосфолипидного бислоя  клеточных мембран и модифицируют текучесть, стабильность и проницаемость мембран. Полагают, что они могут  взаимодействовать с витамином Е, образовывая хорошо отлаженную цепь по перемещению свободных радикалов. Нарушения в работе этой цепи могут повлечь за собой молекулярно-деструктивные процессы в патогенезе многих заболеваний, в том числе печени [1] .

       При различных острых и хронических заболеваниях, протекающих с повреждением клеточ­ных мембран при дефиците долихола и недостаточности долихилфосфатно­го цикла, заместительный эффект полипре­нолов способствует поддержанию им­мунного статуса клетки, обеспечивая восстановление, стабильность мембран, а также синтез белко­вых молекул.  Ранее было показано, что препарат "Ропрен" обладает иммуномодулирующими свойствами, повышает гуморальный ответ организма на фагоцитоз, что может быть успешно использовано не только  при лечении различных инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний [2], но и при заболеваниях печени.

      Использование препарата «Ропрен» при различных заболеваниях печени даст возможность компенсиро­вать дефицит долихолов, активизировать процессы фосфорилирования, энергообеспечения печени и регенерации биомембран и тем самым корригировать нарушения, оказывая лечебное воздействие.

       Изучить  и оценить гепатопротекторное дей­ствие полипренольного препарата "Ро­прен" на модели токсического поражении печени у животных на модели токсического гепатита, вызванного дихлорэтаном и фенацетином.  Сравнить действие нового препарата с известными гепатопротекторами.

Экспериментальные исследования проводились на 365 нелинейных белых крысах-самцах, полученных из питом­ника Рапполово (Ленинградская об­ласть). Возраст крыс составил 3,5 ме­сяца, масса тела – 150–170 г. Ежеднев­но на протяжении 20 дней все живот­ные взвешивались и осматривались. Осмотр  включал в себя оценку общего состояния и поведения. Препаратами сравнения являлись общепризнанные лекарственные гепатопротекторы при­родного происхождения "Эссенциале" и "Легалон". Для моделирования ток­сического гепатита использовали дих­лорэтан и ацетаминофен (фенацетин), которые вводили крысам внутрижелу­дочно через металлический атравматич­ный зонд в дозах соответственно 500 и 400 мл/кг, 1 раз в день на протяжении 4 дней в смеси с подсолнечным маслом (1:1). Кроме того, использовали соче­танное введение дихлорэтана и ацета­минофена в дозах 300 и 250 мл/кг соот­ветственно. Через 10 дней у животных подтвердилось наличие токсического гепатита по морфологической картине печени. C этого времени на протяжении 10 дней всем животным внутрижелу­дочно вводили 1 раз в сутки: «Ропрен» по 0,1 мл/кг или препараты сравнения: «Эссен­циале» из ампул по 1 мл/кг, «Легалон» – по 100 мл/кг. Биохимические и морфоло­гические исследования проводили на 20-й день эксперимента. Об эффектив­ности лечения судили по клинической картине, динамике массы тела и отно­сительной массы печени; содержанию билирубина, трансаминаз, фосфатаз, це­рулоплазмина, общего белка, липидов сыворотки крови; содержанию гликоге­на, глутатиона, SH-групп, цитохромов в печени, нагрузочным пробам (гексена­ловый тест, бромсульфоалеиновая про­ба) и гистологической картине печени. Гистологический анализ печени проводили через 1, 3 и 10 дней. Печень декапитированных животных фиксировали в 15% формалине и зали­вали в парафин. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилин-эози­ном.  Для выявления жировой дистрофии печени гистологические срезы окрашивалиСуданом. Гистологический анализ проводили с использованием световой микроскопии. Результаты экспериментов обраба­тывали с помощью  критерия Стьюдента.

        В качестве препаратов сравнения использовали известные гепатопротекторы - «Эссенциале форте» на основе фосфолипидов и «Легалон» на основе экстракта   расторопши пятнистой (Silybum marianum), основным компонентом которого является силимарин. Сам силимарин представляет собой смесь 3-х основных изомерных соединений - силибинина, силикристина и силидианина. В « Легалоне»  соотношение этих компонентов составляет- 3:1:1. Одним из критериев – была выживаемость животных в опыте. К 20 дню эксперимента в группе токсического поражения печени дихлорэтаном без лечения погибло 40% животных, а при лечении «Легалоном» -10%. После воздействия фенацетином за это время погибло 60% животных, а в группе леченной «Легалоном» - 30%. В группах при лечении «Ропреном» и «Эссенциале форте» летальности животных не наблюдалось. Клиническая картина в группах животных без лече­ния (негативный контроль) характеризовалась гиподинамией, снижением аппетита (уменьшением потребления корма и воды), затормо­женностью, взъерошенностью шерсти. Наблюдалась некоторая желтушность слизистых оболочек и склер, увели­чение размеров печени. При интоксикации животных дихлорэтаном и фенацетином достоверно снижалась масса тела и повышалась относительная масса печени животных. Лечение животных «Ропреном» позволило вернуть массу тела и относительную массу печени к нормальным показателям в большей степени, чем лечение «Леганолом» и «Эссенциале форте».

      Для изучения гепатопротекторного действия препаратов были проведены биохимические исследования крови у животных в контрольных и опытных группах до лечения, и после лечения на 20-й день. ( Табл.1,2.).Биохимиче­ские показатели крови животных свидетельствуют о явных нарушениях функции печени (Табл.1). На 20-й день эксперимента в контрольных группах животных, получивших дихлорэтан и фенацетин, отмечалось вы­раженное повышение активности  ферментов  в среднем АЛТ (в 8,0 раз), АСТ (в 1,6 раза), ЩФ (в 3 раза), КФ (в 2,7 раза) и уровня ЛДГ (в 2 раза). Это свидетельство­вало о нарушении функционального состояния пече­ни и развитии токсического гепатита (Табл.1).

 

 

 

 

Таблица 1. Биохимические показатели крови животных при лечении

 

 

АлТ – аланинаминотрансфераза,

АсТ – аспартатаминотрансфераза,

ЩФ – щелочная фосфатаза,

КФ – кислая фосфатаза,

ЛДГ – лактатдегидрогеназа,

ХЭ – холинэстераза.

Для таблиц 1–4:

* – статистически достоверное отличие от группы интактных животных (p < 0,05).

 

 

        Так, уровень билирубина в группе с дихло­рэтаном и фенацетином достоверно по­высился соответственно до 6,2 ± 0,4 и 6,8 ± 0,2 мкмоль/л, т.е. в 2 раза  по сравнению с интактными животными(3 ± 0,3 мкмоль/л). Об этом свиде­тельствовало также и повышение уров­ня ЩФ и КФ (Табл. 1). Показатели белкового обмена в печени резко снижаются - общий белок в 1,6 раза, а гликоген в 3,1 раза. При интоксикации вышеуказанны­ми веществами в самой печени умень­шились запасы гликогена, а также  уровень деток­сикационных цитохромов и особенно уровень восстановленного глутатиона. Активация окислительного процесса в печени под действием гепатотоксинов приводит к снижению уровня восстановленного глютатиона в среднем в 2 -2,5 раза, а также  холинэстеразы и цитохромов Р 450 и Р 5.(Табл.3). Поражение печени  и развитие токсического гепатита подтверждалось снижением ее функциональной активности в отношении микросомальных ферментов. Длительность гексеналово­го сна возрастала  в 2 раза (Табл. 3).

     При  изучении  лечебного эффекта  препарата «Ропрен» было установлено, что биохимические показатели крови у животных вернулись к норме после лечения. По основным показателям  действие «Ропрена» превышало действие «Эссенциале» и « Легалона».  Так, уровень общего белка в крови после лечения «Ропреном» как в группе с дихлорэтаном, так и в группе с фенацетином, составлял соот­ветственно 58± 5 г/л  и  59 ± 5 г/л, что было близко к данным показателям в интактной группе животных. Уровень белка при лечении «Леганолом» и «Эссенциале» был несколько ниже, соответственно 50-48г/л и 56-54г/л. Уровень гликогена в печени после лечения «Ропреном» увеличился  в 2,5 раза (2000 мг%) и достиг практически  первоначальных значений у интактных животных. Уровень гликогена в печени при лечении  известными гепатопротекторами был ниже:  в случаях с «Легалона» 1100-1300мг%, «Эссенциале» -1800-1900мг%.

         В результате лечения «Ропреном» уровень актив­ности трансаминаз в крови практически полностью восстановился до нормы, достовер­но нормализовался  также и уровень других ферментов (табл.1, 2). Явления холестаза исчезли, что можно наблюдать по восстановлению содержания билирубина и  щелочной фосфатазы  до исходного уровня в крови. Уровень билирубина в крови животных, получавших «Легалон» к концу опыта снижался незначительно. Особенно эффективно идет  процесс снижения активности  щелочной фосфатазы, которая, как известно,   находится на поверхности клеточных мембран и особенно много ее находится в желчных протоках печени.  Этот факт указывает на активное участие препарата «Ропрен» в процессах фосфорилирования на мембранах клеток и  его способности регенерировать   поврежденные клеточные мембраны. Хочется отметить  действие препарата «Ропрен» на уровень  общего холестерина: при повреждении печени: уровень холестерина повышается, а после лечения «Ропреном» он не только приходит в норму, но и   немного снижается ниже нормы, что может говорить об участии препарата в перераспределении липидов в бислое мембраны клетки. В группах животных с  «Легалоном» и «Эссенциале» уровень холестерина восстанавливается, но не снижается.

  По сравнению с лече­нием  препаратами «Легалон» и «Эссенциале», применение «Ропрена» обеспечило полное восстановление функциональ­ной активности печени, нормализацию уровня восстановленного глутатиона до 160-170мг%, тогда как в группах, получавших «Эссенциале» и «Легалон» эти показатели были значительно ниже: 140-150±8мг% для «Эссенциале» и 120-130±13мг% - для «Легалона». Улучшение детоксикационной системы цитохромов в печени приближалось к норме под действием «Ропрена» в большей степени, чем под действием препаратов «Эссенциале» и «Легалон» (Табл. 3, 4).

Таблица 3. Показатели функции печени животных при лечении препаратом «Ропрен», М ± m

Таблица 4.   Показатели функции печени животных при лечении

 

 

   Проба на «гексеналовый сон» показывает, что под действием препарата «Ропрен» и «Эссенциале» происходит восстановление активности микросомальных ферментов печени, тогда, как длительность сна при использовании «Леганола» -  остается в более высоких пределах – 30 – 35 ±1,2 минуты, что свидетельствует о неполном восстановлении детоксикационной функции печени.

   Результаты проведенных биохими­ческих исследований были подтверж­дены гистологическим анализом  структуры печени и  морфологической картиной  действия исследуемых препаратов. Печень животных исследовали через 1, 3 и 10 дней. При просмотре гистологических срезов печени животных через сутки, наблюдались признаки острого токсического гепа­тита. На  срезах, окрашенных су­даном, было видно, что цитоплазма ге­патоцитов густо заполнена мелкими и крупными каплями жира, что свидетельствует о жировой дистрофии печени. Жировая дис­трофия печени носила диффузный ха­рактер (рис.1 a).  На срезах, окра­шенных гематоксилин-эозином, наблю­далась вакуолизация цитоплазмы гепа­тоцитов, набухание клеточных тел, не­четкость клеточных границ и бледная окраска некоторых групп ядер, что яв­ляется свидетельством также и белко­вой дистрофии печени (рис. 1 б). У животных,  принимавших  «Ропрен», степень и распространен­ность жировой дистрофии были менее выражены, чем у  живот­ных, получавших препараты «Легалон» и «Эссенциале».

Назна­чение  препарата «Ропрен» к 10 дню опыта  значительно улучшало морфологическую  картину печени. Так, исследование метаболической функции печени показало, что у животных, полу­чавших препарат «Ропрен», оказалось большее содержание гликогена по сравнению с животными, не получавшими препарата (рис. 2). «Ропрен» значительно улучшал гистологическую картину органа по сравнению с лечением «Легалоном», а при лечении «Эссенциале» можно было наблюдать остаточные явления гепатита.

 Исследование пролифератив­ной и репаративной функции паренхи­мы печени показало, что у животных, получавших «Ропрен» в сравнении с интактными животными, кроме обычно со­держащих одно ядро гепатоцитов, ча­сто встречались двуядерные гепатоци­ты (рис. 3,4,5), которые либо осуществля­ли амитотическое деление, либо завер­шали его.  Двухядерность гепатоцитов, как принято считать, является своеобразным механизмом приспособления для увеличения поверхностных отношений между ядром и цитоплазмой, особенно при повышенной нагрузке на орган, например, при осуществлении репаративных процессов в поврежденной  печени.

Полученные дан­ные гистологического анализа свидетельствует о восстановлении функциональной активности и усиле­нии регенерации пече­ночной ткани в результате лечения «Ро­преном». Ниже приведены  рисунки, сделанные на основании гистологического анализа срезов и доказывающие значительную положительную морфологическую динамику   изменений   в печени опытных животных под действием препарата «Ропрен».

 

 

 

         Таким образом, действие препарата «Ропрен»  направлено на   стимуляцию репаративно-регенерационных процессов в печени, повышение устойчивости органа за счет мембрано-стабилизирующего, антитоксического действия, уменьшения окислительной нагрузки на печень. Под действием  «Ропрена» происходит нормализация процессов фосфорилирования  и энергообеспечения  в поврежденных мембранах, что способствует регенерации   печени и компенсирует недостаточность долихола в долихилфосфатном цикле. Для  полного восстановления функции   мембран огромное  значение  имеют антиоксидантные и метаболические свойства «Ропрена». Последние направлены на  стимуляцию синтеза белка и ускорение регенерации поврежденной структуры печени.  Таким образом, в опытах на животных было показано, что препарат «Ропрен» стимулирует выработку ферментов, активно влияет на  липидный, жировой, белковый обмен.  

  

       Полипренольный препарат "Ропрен" значительно улучшает функциональное и морфологическое состояние печени у животных на модели токсического гепатита, вызванного дихлорэтаном и фенацетином. В результате проведенных исследований, было установлено гепатопротекторное действие   препарата «Ропрен», превышающее действие таких известных   препаратов, как «Легалон» и «Эссенциале». Действие препарата « Ропрен» направлено на   стимуляцию репаративно-регенерационных процессов в печени, повышение устойчивости органа за счет мембрано-стабилизирующего, антитоксического действия, уменьшения окислительной нагрузки на печень. Под действием препарата происходит нормализация процессов фосфорилирования и энергообеспечения в поврежденных мембранах, что компенсирует недостаточность долихола в долихилфосфатном цикле. Метаболическое действие «Ропрена» состоит в стимуляции синтеза белка, ускорении регенерации поврежденных гепатоцитов, усилении антиоксидантной системы защиты.  Вы­явленная специфическая активность препарата  «Ро­прен» позволяет рекомендовать его для дальнейшего изучения в качестве   нового высоэффективного гепатопротекторного средства растительного происхождения.